Dal genoma all’epigenoma

La metilazione del DNA è un meccanismo estremamente importante in quanto, insieme alle modificazioni covalenti degli istoni (proteine che compattano il DNA), modifica la struttura della cromatina e l’accessibilità del DNA ai fattori di regolazione dell’espressione dei geni.Oggi, grazie al lavoro pubblicato su Nature di alcuni ricercatori dell’Università di San Diego, in California, abbiamo a disposizione la mappa delle modificazioni

La metilazione del DNA è un meccanismo estremamente importante in quanto, insieme alle modificazioni covalenti degli istoni (proteine che compattano il DNA), modifica la struttura della cromatina e l’accessibilità del DNA ai fattori di regolazione dell’espressione dei geni.

Oggi, grazie al lavoro pubblicato su Nature di alcuni ricercatori dell’Università di San Diego, in California, abbiamo a disposizione la mappa delle modificazioni epigenetiche del genoma umano in cellule staminali embrionali e fibroblasti polmonari (cellule del tessuto connettivo). Il tutto con una risoluzione a livello di singola base!

Gli autori hanno utilizzato il metodo di trattamento con bisolfito di sodio che converte i residui di citosina, ma non le metilcitosine, ad uracile. Successivamente, sequenziando il genoma, è possibile così visualizzare quali residui non hanno subito conversione e quindi identificarli come citosine metilate.

Grazie a questo metodo sono state analizzate circa il 94% delle citosine dell’intero genoma, in entrambi i tipi cellulari: embrionali staminali e fibroblasti polmonari fetali. In particolare, sono state rilevate rispettivamente 62 milioni e 45 milioni di metilcitosine. Per quanto riguarda i fibroblasti, il 99,98% di queste si trova in un contesto ricco di C e G; al contrario nelle cellule staminali la metilazione è concentrata in sequenze ricche di A e T. Inoltre, cellule embrionali indotte a differenziarsi perdono la metilazione a livello di sequenze non-CG, mentre mantengono la metilazione nelle sequenze ricche in CG: questo indica che la metilazione diffusa a livello non-CG viene persa durante il differenziamento. Quindi, mentre precedenti studi avevano ipotizzato l’esistenza di metilazione pressoché unicamente in sequenze ricche di C e G nei mammiferi, queste osservazioni portano a supporre che la metilazione non-CG sia una caratteristica generale, almeno per quanto riguarda le cellule staminali embrionali umane.

L’assenza di metilazione non-CG nei fibroblasti coincide con una minor presenza di DNA metiltransferasi “de novo” (DNMT3A, DNMT3B e DNMT3L), cioè di enzimi che catalizzano l’aggiunta di gruppi metile in residui precedentemente non metilati. Al contrario le metiltransferasi cosiddette “di mantenimento” riproducono il pattern di metilazione in un filamento del DNA basandosi su quello che si osserva nell’altro filamento.

La densità di metilazione del DNA varia fortemente lungo ciascun cromosoma: le regioni sub-telomeriche (vicine alle estremità) spesso mostrano un elevato tasso di metilazione, importante per il controllo della lunghezza dei telomeri e per la ricombinazione. In generale, si osserva una densità inferiore di metilazione a livello delle cosidette “isole CG” e dei siti di inizio della trascrizione (TSS).

A livello delle sequenze non-CG si osserva inoltre una correlazione positiva tra espressione genica e densità di metilazione, con i geni più espressi che contengono una densità di metilazione tre volte più alta che i geni non espressi. Tuttavia, non è stata rilevata alcuna correlazione tra densità di metilazione CG ed espressione genica nelle cellule staminali. L’analisi dei geni ha mostrato una densità di metilazione particolarmente elevata per geni coinvolti nel processamento dell’RNA, nello splicing e nei processi metabolici di quest’ultimo. Inaspettatamente, è stato trovato un arricchimento di metilazione non-CG a livello del filamento antisenso delle regioni codificanti dei geni. Questo filamento serve normalmente come stampo per la polimerizzazione (sintesi) dell’RNA e allo stato attuale non si conosce il ruolo che potrebbe avere questa metilazione.

E’ stata successivamente determinata una preferenza per la distanza tra siti adiacenti di metilazione. E’ evidente dallo studio una periodicità di 8-10 basi tra metilcitosine successive, che corrispondono ad un singolo giro dell’elica del DNA: questo indica che esiste un meccanismo molecolare alla base della metilazione de novo. Questo pattern si osserva anche nel genoma di Arabidopsis, indicando un comune principio di funzionamento sotteso sia al regno animale che a quello delle piante. Uno studio strutturale delle metiltransferasi di mammifero DNMT3A e DNMT3L mostra che due copie di ciascuna formano un eterotetramero che contiene due siti attivi separati da circa 8-10 nucleotidi sull’elica del DNA: potrebbe quindi essere proprio DNMT3A a catalizzare la metilazione a livello di questi siti non-CG, data la perfetta simmetria enzima-substrato che così si osserva.

Numerosi studi hanno documentato una correlazione tra metilazione del DNA ed abilità di alcune proteine di interagire con le proprie sequenze target. Gli autori di questo studio hanno confermato queste ipotesi, notando una diminuzione nel profilo della densità di metilazione relativa verso i siti di interazione (in particolare nel contesto non-CG). La diminuita densità è indipendente dalla prossimità con i siti di inizio della trascrizione in tutti i tipi cellulari analizzati e quindi essa è anche indipendente dal legame effettivo o meno di queste proteine.

Un’altra modalità di regolazione dell’espressione genica molto importante interessa le regioni “enhancer”: corte sequenze di DNA in grado di legare proteine attivatrici che facilitano il reclutamento della RNA polimerasi, e quindi la trascrizione del gene regolato. E’ stata osservata una diminuzione di metilazione a livello di enhancer specifici nei fibroblasti, ma un’opposto arricchimento di densità di metilcitosine nelle stesse regioni in cellule staminali embrionali. Viceversa, a livello di enhancer specifici staminali non varia la densità di metilazione né nelle cellule staminali embrionali stesse né nei fibroblasti. Al contrario però, la densità di metilazione non-CG in questi siti diminusce di circa tre volte. Ciò indica il mantenimento di questi elementi in uno stato non metilato, prevenendo così interferenze nel processo di interazione proteina-DNA. La specifica tipologia di de-metilazione (non-CG nelle cellule staminali; CG nei fibroblasti) potrebbe indicare un utilizzo dei differenti tipi di metilazione specifico per ciascun tipo cellulare.

Un altro paradigma della metilazione del DNA è che questa controlli aspetti del differenziamento cellulare. Ovviamente questo implica che i pattern di metilazione varino nei diversi tipi cellulari, così  come documentato in diversi studi. Gli autori hanno quindi ulteriormente confrontato i metilomi dei due tipi cellulari umani analizzati in questo articolo. Sorprendentemente è stato osservato che una larga porzione del genoma di fibroblasto mostra livelli inferiori di metilazione rispetto alle cellule staminali. In particolare, sono state osservate regioni contigue con un livello di metilazione medio del 70%, che gli autori hanno soprannominato “domini parzialmente metilati” (PMD). Nelle cellule staminali il 42% dei geni più espressi è collocato all’interno di PMD, mentre nei fibroblasti questa percentuale scende al 13%. In questi ultimi è stata inoltre osservata una correlazione positiva tra livello di metilazione medio nei corpi dei geni ed espressione genica. Nelle cellule staminali, invece, questo non è stato riportato.

Quindi si potrebbero interpretare i dati emersi non tanto come correlazione positiva tra espressione genica e metilazione del corpo dei geni. Piuttosto, sarebbe forse più corretto parlare di una diminuzione di metilazione in geni repressi nelle cellule differenziate.

I ricercatori hanno dunque trovato notevoli differenze tra i metilomi dei due tipi cellulari umani, rivelando la natura estremamente dinamica di questa modificazione epigenetica. Si è scoperto che vi è abbondanza di metilazione a livello di un contesto non-CG, che è tipicamente ignorato dalle altre metodiche utilizzate in precedenza. Il diverso pattern di metilazione all’interno dei geni e la correlazione con l’espressione suggerisce ruoli alternativi della metilazione nei due contesti: ricco in CG o in AT. L’esistenza di metilazione non-CG esclusivamente a livello delle cellule staminali, probabilmente mantenuta dalla continua attività delle de novo metiltransferasi, suggerisce che questo meccanismo potrebbe avere un ruolo chiave nell’origine e nel mantenimento dello stato pluripotente.  

Ilaria Panzeri


Riferimenti:
Ryan Lister et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. doi:10.1038/nature08514